Teknik Ekstraksi RNA untuk PCR

Ekstraksi RNA

Ekstraksi RNA dari darah

Metode ini sangat bisa diandalkan tanpa membutuhkan sentrifugasi gradien CsCl. Seperti Protokol ekstraksi RNA secara umum, setiap tahap perlu dilakukan secara hati-hati agar kontaminasi RNAse yang bersumber dari sampel dapat dicegah. Semua alat dan reagen yang digunakan harus bersifat bebas RNAse.

Ilustrasi Ekstraksi RNA dengan PhOH-CHCl3
(Sumber: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:PhOH-CHCl3_extraction.svg)

Alat dan bahan

1. Tabung microfuge (1,5 mL).
2. Ember es.
3. Microfuge.
4. Buffer lisis sel darah merah: sukrosa 1,6 M, Triton X-100 5%, MgCl2 25 mM, Tris-HCl 60 mM, pH 7,5; disimpan pada 2-8 ° C dan digunakan dingin.
5. Buffer Ekstraksi: 5,25 M guanidinium tiosianat, 50 mM Tris-Cl, pH. 6,4, 20 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0,1 M β-mercaptoethanol (tambahkan segera sebelum digunakan).
6. 2 M natrium asetat, pH 4.0.
7. Fenol jenuh dengan 1 M Tris-HCl: 0,1 M EDTA, pH 8,0.
8. Chloroform: Iso-amyl alcohol (24 1).
9. Isopropil alkohol.
10. 70% Etanol.               
11. Aquades bebas RNAse

Langkah kerja

1. Dalam tabung microfuge, campur 100 μL darah antikoagulan dengan 1 mL buffer lisis sel darah merah (lihat Catatan 1–3).
2. Biarkan pada suhu kamar dengan melakukan homogenisasi sesekali hingga sel-sel merah telah lisis dan larutan tembus cahaya (±5 menit).
3. Microfuge selama 30 detik dengan kecepatan 13.000 g untuk mengendapkan sel darah putih. Buang supernatan
4. Tambahkan 200 μL buffer ekstraksi dan resuspensi endapan sel pemipetan menggunakan spuit secara berulang.
5. Tambahkan 20 μL natrium asetat 2 M dan homogenkan dengan membalikkan tabung secara perlahan
6. Tambahkan 220 μL fenol dan homogenkan dengan membalikkan tabung secara perlahan.
7. Tambahkan 60 μL chloroform / isoamyl alcohol (24:1) dan vortex dengan kecepatan penuh.
8. Letakkan di atas es selama 15 menit.
9. Microfuge pada 12.000g selama 5 menit dan pipet supernatant ke tabung microfuge baru.
10. Tambahkan 200 μL campuran isopropanol dingin dan simpan pada –20 ° C selama 30 menit.
11. Microfuge pada 12.000 g selama 15 menit dan buang supernatan.
12. Resuspensi pellet sel dalam 200 μL buffer ekstraksi.
13. Ulangi langkah 3 hingga 9.
14. Cuci pellet dengan 400 μL etanol 70% dingin.
15. Microfuge pada 12.000 g selama 5 menit dan buang supernatan.
16. Buang sisa etanol dari tabung dengan hati – hati (dapat menggunakan swab steril).
17. Resuspensi dalam 100 μL aquades dan inkubasi pada suhu 50 ° C selama 15 menit untuk melarutkan RNA (lihat Catatan 4)

Catatan

1. Darah yang disimpan pada suhu kamar atau 4° C harus dihomogenkan dengan sempurna sebelum alikuot dibuang.
2. Sampel darah beku harus dibiarkan mencair sepenuhnya dan tercampur rata sebelum alikuot dihapus. Meskipun proses pembekuan akan melisiskan sel darah merah, langkah lisis sel darah merah harus tetap dilakukan untuk menghilangkan hemoglobin secara efisien dari sampel. Proses pembekuan / pencairan yang berulang harus dihindari.
3. Buffy coat mengandung dua hingga empat kali lipat jumlah sel darah putih per volume darah segar. Oleh karena itu, disarankan untuk hanya menggunakan 50 μL buffy coat yang diencerkan dengan 50 μL saline yang mengandung fosfat sebagai bahan awal untuk protokol ini.
4. Pemipetan berulang melalui ujung yang sempit dapat membantu proses ini.

Ekstraksi RNA dari potongan jaringan

Ada dua metode persiapan jaringan untuk histologi, yaitu paraffin-embedding dan freeze-embedding. Masing-masing memiliki kelebihan dan kekurangan. Paraffin-embedded tissues (PET) mampu menghasilkan morfologi yang optimal tetapi memiliki kemampuan mempertahankan molekul yang relatif kurang baik. Meskipun potongan beku (frozen section) menunjukkan histologi yang kurang baik, metode tersebut memungkinkan pertahanan DNA dan RNA yang sangat baik untuk analisis. Meskipun fiksasi dilakukan untuk menjaga morfologi jaringan hidup, fiksasi memberikan pengaruh terhadap DNA dan RNA. Formalin, sebagai salah satu fiksatif yang paling populer, mengikat asam nukleat dengan protein, sehingga membuat molekul kaku dan lebih rentan terhadap perubahan mekanis. Durasi fiksasi formalin juga memberikan pengaruh penting. Studi mengenai recovery DNA sekitar 200 pasangan basa merekomendasikan fiksasi selama 16 hingga 24 jam. RNA bersifat lebih labil dan proses penanaman pada parafin terbukti dapat merusaknya. Banyak penelitian telah menunjukkan bahwa fiksasi formalin memberikan efek terburuk di antara fiksatif yang umum digunakan, dan fiksatif berbasis etanol memiliki kemampuan terbaik dalam mempertahankan RNA.

Pengambilan jaringan (sampel) untuk ekstraksi
(Sumber: https://flickr.com/photos/38254448@N05/15847124478)

Alat dan bahan

1. Tabung microfuge (1,5 mL).
2. Ember es.
3. Microfuge.
4. Buffer Ekstraksi: 5,25 M guanidinium tiosianat, 50 mM Tris-HCl, pH. 6,4, 20 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0,1 M β-mercaptoethanol (tambahkan segera sebelum digunakan.
5. Glikogen (10 mg / mL) dalam air suling.
6. 2 M natrium asetat, pH 4.0.
7. Fenol (jenuh dengan 1 M Tris-HCl, 0,1 M EDTA, pH 8.0).
8. Chloroform iso-amyl alcohol (24 1).
9. Isopropil alkohol.
10. 70% etanol.
11. Air suling bebas RNAse

Langkah kerja

1. Ekstraksi dimulai dengan menginkubasi potongan jaringan dalam 500-μL buffer ekstraksi selama 5 menit pada suhu ruang dengan homogenisasi dengan cara membalikkan tabung beberapa kali secara perlahan.
2. Tambahkan 20 μL 2 M natrium asetat dan homogenkan dengan cara membalikkan tabung beberapa kali secara perlahan.
3. Tambahkan 220 μL fenol dan homogenkan dengan cara membalikkan tabung beberapa kali secara perlahan.
4. Tambahkan 60 μL kloroform / isoamyl alkohol (24:1) dan vortex dengan kecepatan penuh.
5. Letakkan di atas es selama 15 menit.
6. Microfuge pada 12.000 g selama 5 menit dan memipet supernatan ke dalam tabung microfuge baru.
7. Tambahkan 1- 2 μL glikogen (10 mg / mL). Glikogen adalah carrier yang digunakan jika jumlah RNA kurang dari 1 ug. Pemberian glikogen juga membantu visualisasi pelet.
8. Tambahkan 200 μL campuran isopropanol dingin dan simpan pada –20 ° C selama 30 menit.
9. Microfuge pada 12.000g selama 15 menit dan buang supernatan.
10. Resuspensi pellet sel dalam 200 μL buffer ekstraksi.
11. Ulangi langkah 3 hingga 9.
12. Cuci pelet dengan 400 μL etanol 70% dingin.
13. Microfuge pada 12.000g selama 5 menit dan buang supernatan.
14. Buang tetes etanol terakhir dari tabung (bisa menggunakan swab steril).
15. Resuspensi dalam 100 μL aquades bebas RNAse dan inkubasi pada suhu 50 ° C selama 15 menit untuk melarutkan RNA.

Oleh: E.Y. Wulandari

Referensi:

Bartlett, J. M. S. et al. (2003) ‘Methods in Molecular Biology: PCR Protocols Second Edition’, Methods in Molecular Biology, 226.