Teknik Ekstraksi DNA untuk PCR

Ekstraksi DNA

Ekstraksi DNA dari whole blood

Prosedur ini adalah salah satu yang digunakan secara rutin baik dalam penelitian dan layanan klinis karena sifatnya yang ekonomis dan praktis. Metode ini juga dapat diterapkan pada pelet sel dari jaringan yang terdispersi atau kultur sel (dengan mengabaikan tahap lisis sel darah merah).

Prinsip Ekstaksi DNA dan RNA dengan mengggunakan TRIzol

https://www.creative-diagnostics.com/total-protein-extraction-by-trizol.htm

Alat dan bahan:

1. Waterbath dengan suhu 65 ° C.
2. Tabung centrifuge (15 mL; Falcon).
3. Tabung Microfuge (1,5 mL).
4. Rotator.
5. pipet Pasteur kaca
6. EDTA (0,5 M) pH 8,0:
7. Tambahkan 146,1 g EDTA anhidrat ke 800 mL aquades.
8. Sesuaikan pH hingga 8,0 dengan pelet NaOH (ini akan membutuhkan sekitar 20 g). Buat hingga 1 L dengan air sulingan. Autoclave pada 15 hal.s.i. selama 15 menit.
9. 7. 1 M Tris-HCl, pH 7,6:
10. Larutkan 121,1 g basa Tris dalam 800 mL air suling.
11. Menyesuaikan pH dengan HCl pekat (ini membutuhkan sekitar 60 mL). PERHATIAN: penambahan asam menghasilkan panas. Biarkan campuran mendingin hingga suhu kamar sebelum akhirnya mengoreksi pH.
12. Buat hingga 1 L dengan air suling. Autoclave pada 15 hal.s.i. selama 15 menit.
13. Reagen A: Lisis sel darah merah: 0,01M Tris-HCl pH 7,4, sukrosa 320 mM, 5 mM MgCl2, 1% Triton X 100.
14. Tambahkan 10 mL 1 M Tris, 109,54 g sukrosa, 0,47 g MgCl2, dan 10 mL Triton X-100 hingga 800 mL air suling. Sesuaikan pH menjadi 8,0, dan make up hingga 1 L dengan air suling. Autoclave pada 10 ps.s.i. selama 10 menit (lihat Catatan 1).
15. Reagen B: Lisis sel: 0,4 M Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,06 M EDTA, 1% natrium dodecylsulfat, pH 8,0. Ambil 400 mL Tris 1 M (pH 7,6), 120 mL 0,5 M EDTA (pH 8,0), 8,76 g NaCl, dan sesuaikan pH ke 8,0. Buat hingga 1 L dengan air suling. Autoclave 15 mnt jam 15. p.s.i. Setelah diautoklaf, tambahkan 10 g natrium dodesil sulfat.
16. 5 M natrium perklorat: Larutkan 70 g natrium perklorat dalam 80 mL air suling. Buat hingga 100 mL.
17. TE Buffer, pH 7,6: Ambil 10 mL Tris-HCl 1 M, pH 7,6, 2 mL 0,5 M EDTA, dan buat hingga 1 L dengan air suling. Sesuaikan pH menjadi 7,6 dan autoklaf 15 menit pada 15. p.s.i.
18. Kloroform yang telah disiapkan sebelumnya hingga 4 ° C.
19. Etanol (100%) prechilled hingga 4 ° C

Langkah kerja:

Pengambilan darah: Ambil darah dan tampung dalam tabung vacutainer dengan antikoagulan heparin atau EDTA. Simpan dalam suhu ruang dan lakukan ekstraksi pada hari yang sama.

Ekstraksi DNA:

1. Tempatkan 3 mL darah lengkap dalam tabung falcon 15 mL.
2. Tambahkan 12 mL reagen A.
3. Homogenkan menggunakan rotator selama 4 menit pada suhu ruang.
4. Sentrifus pada 3000g selama 5 menit pada suhu ruang.
5. Buang supernatant secara hati-hati. Jika perlu, usap sisa cairan dengan kertas tisu.
6. Tambahkan 1 mL reagen B dan vortex sebentar untuk membentuk pelet sel kembali.
7. Tambahkan 250 μL natrium perklorat 5 M dan homogenkan dengan membalikkan tabung beberapa kali.
8. Tempatkan tabung di waterbath selama 15 hingga 20 menit pada 65 ° C.
9. Biarkan dingin hingga suhu kamar.
10. Tambahkan 2 mL kloroform dingin.
11. Homogenkan menggunakan rotator selama 30 hingga 60 menit (lihat Catatan 3).
12. Sentrifus pada 2400g selama 2 menit.
13. Pipet supernatant ke tabung falcon.
14. Tambahkan 2-3 mL etanol dingin dan balikkan tabung dengan lembut agar DNA mengendap (lihat Catatan 4).
15. Pipet ke tabung Eppendorf 1,5 mL dan biarkan mengering (lihat Catatan 6).
16. Resuspensi dalam 200 μL buffer TE (lihat Catatan 7 dan 8)

 Catatan:

• Gula yang diautoklaf secara otomatis dapat menyebabkan karamelisasi (perubahan gula menjadi warna coklat), sehingga terjadi degradasi gula.
• Seperti halnya cairan tubuh lainnya, darah merupakan biohazard. Tindakan  pencegahan harus dilakukan pada setiap langkah yang meliputi penanganan darah. Jika subjek berasal dari kategori risiko tinggi yang diketahui (misalnya pelaku penyalahgunaan obat intravena), diperlukan tindakan pencegahan tambahan.
• Rotasi kurang dari 30 atau lebih dari 60 menit dapat mengurangi hasil DNA.
• DNA harus tampak sebagai untai seperti lendir pada fase larutan.
• Putar ujung kait dengan menggulirkan antara ibu jari dan jari telunjuk biasanya bekerja dengan baik. Jika DNA melekat pada kail, pisahkan ke dalam Eppendorf dan lakukan resuspensi DNA sebelum dipindahkan ke tabung baru.
• Etanol akan mengganggu pengukuran konsentrasi DNA dan reaksi PCR. Namun, mengeringkan pelet secara berlebihan akan memperpanjang waktu resuspensi.
• Jumlah EDTA dalam TE yang kecil tidak akan memengaruhi PCR. Penggunaan 1 μL EDTA setiap reaksi PCR tidak menimbulkan pengaruh signifikan pada reaksi.
• DNA dapat dikuantifikasi dan diencerkan ke working concentration pada tahap ini. Gunakanlah 1 μL per reaksi PCR untuk menghasilkan 200-500 ng / μL DNA.

Referensi: 
Bartlett, J. M. S. et al. (2003) ‘Methods in Molecular Biology: PCR Protocols Second Edition’, Methods in Molecular Biology, 226.

Ekstraksi DNA dari jaringan

Metode berikut adalah salah satu metode ekstraksi DNA yang paling lama dikembangkan dan dapat digunakan pada berbagai jaringan padat. Protein dihidrolisis dengan proteinase K dan diekstraksi menggunakan fenol kloroform. DNA kemudian diendapkan dengan etanol. DNA yang dihasilkan (10–50 ug) memiliki berat molekul tinggi dan merupakan template yang sesuai untuk digunakan pada reaksi PCR.

Alat dan bahan:

1. Tabung microfuge 1,5 mL.
2. Shaking waterbath
3. Microfuge.
4. DNA digestion buffer: 50 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% SDS, pH 8,0.
5. Proteinase K: 0,5 mg / mL dalam DNA digestion buffer
6. Fenol / kloroform / isoamyl alkohol (25:24:1).
7. 100% EtOH.
8. 70% EtOH.
9. TE buffer: 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0

Langkah kerja:

1. Tempatkan 0,1 hingga 0,5 g jaringan ke dalam tabung microfuge polypropylene (lihat Catatan 1).
2. Tambahkan 0,5 mL DNA digestion buffer dengan proteinase K (lihat Catatan 2).
3. Inkubasi semalaman pada suhu 50 hingga 55ºC dengan getaran lembut.
4. Putar tabung selama 5 detik pada 500g untuk mengumpulkan campuran di bagian bawah tabung.
5. Tambahkan 0,7 mL fenol / kloroform / isoamil alkohol (25 24 1).
6. Homogenkan dengan membalikkan tabung selama 1 jam (jangan vortex).
7. Microfuge pada 12.000 g selama 5 menit dan pipet 0,5 mL supernatan ke tabung microfuge baru.
8. Tambahkan 1 mL etanol 100% pada suhu kamar dan balik perlahan sampai terbentuk endapan DNA (±1 menit).
9. Microfuge pada 12.000 g selama 5 menit dan buang supernatan.
10. Tambahkan 1 mL etanol 70% (–20ºC) dan balikkan beberapa kali. Tahap pencucian dengan etanol ini menghilangkan kelebihan garam yang dapat mengganggu PCR.
11. Microfuge pada 12.000 g selama 5 menit dan buang supernatan.
12. Putar tabung selama 5 detik untuk mengumpulkan etanol yang tersisa di dasar tabung. Keringkan tetes terakhir etanol.
13. Keringkan pada suhu ruang selama 10 hingga 15 menit (pengeringan yang lebih lama akan membuat DNA sulit larut kembali).
14. Resuspensi dalam 100 μL TE dan inkubasi pada 65 ° C selama 15 menit untuk melarutkan DNA (lihat Catatan 3).

Catatan:

• Beberapa jaringan mengandung sejumlah besar jaringan ikat dan sulit dicerna. Oleh karena itu, diperlukan tahap pembekuan dalam nitrogen cair dan penumbukan menggunakan mortar dan alu sebelum dapat dihidrolisis dengan proteinase K.
• Larutan Proteinase K dapat disimpan selama beberapa hari pada suhu 4 ° C.
• Pemipetan yang berulang melalui ujung pipet yang sempit dapat membantu proses ini.

Oleh: E.Y. Wulandari

Referensi: 
Bartlett, J. M. S. et al. (2003) ‘Methods in Molecular Biology: PCR Protocols Second Edition’, Methods in Molecular Biology, 226.