Prinsip Metode PCR

Prinsip PCR

Polymerase Chain Reaction PCR adalah suatu metode yang memungkinkan untuk memperoleh beberapa salinan fragmen DNA dari suatu ekstrak dengan replikasi in vitro. Amplifikasi ini didasarkan pada replikasi template DNA untai ganda. Proses pada metode PCR secara garis  besar dibagi menjadi tiga fase yaitu fase denaturasi, fase hibridisasi dengan primer, dan fase elongasi.
Produk dari setiap langkah sintesis berfungsi sebagai template (cetakan) untuk langkah-langkah berikutnya, sehingga tercapai amplifikasi secara eksponensial [1,2].

Metode PCR dilakukan dalam campuran reaksi yang terdiri dari ekstrak DNA (DNA template), Taq polimerase, primer, dan four deoxyribonucleoside triphosphates (dNTPs) secara berlebih dalam larutan buffer. Tabung yang berisi campuran tersebut akan mengalami siklus suhu berulang beberapa puluh kali dalam blok pemanas dari siklus termal. Blok pemanas merupakan suatu alat yang berfungsi sebagai tempat untuk menyimpan tabung sampel. Alat ini dapat menghasilkan suhu yang bervariasi, dari 0 hingga 100⁰C dengan efek Peltier, sehingga setiap tahap PCR dapat berjalan dengan baik [1]. Pengaturan durasi dan suhu yang dibutuhkan tiap siklus dapat diatur dan diprogram pada alat ini. Setiap siklus mencakup tiga periode dengan rentang waktu beberapa puluh detik. Adapun tahapan pada proses PCR alah sebagai berikut:

a.    Denaturasi

Di dalam proses PCR, proses denaturasi awal dilakukan sebelum enzim taq polimerase ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Denaturasi DNA merupakan proses pembukaan DNA untai ganda menjadi DNA untai tunggal. Proses ini biasanya berlangsung sekitar 3 menit, untuk meyakinkan bahwa molekul DNA terdenaturasi menjadi DNA untai tunggal yang sempurna. Denaturasi yang tidak lengkap mengakibatkan DNA mengalami renaturasi (kembali membentuk DNA untai ganda) secara cepat, dan ini mengakibatkan gagalnya proses PCR. Adapun waktu denaturasi yang terlalu lama juga dapat mengurangi aktifitas enzim Taq polymerase. Aktifitas enzim tersebut mempunyai waktu paruh lebih dari 2 jam, 40 menit, 5 menit masing-masing pada suhu 92,5^o C; 95^o C dan 97,5^o C [3].

b.    Annealing (Penempelan Primer)

Kriteria yang umum digunakan untuk merancang primer yang baik adalah bahwa primer sebaiknya berukuran 18 – 25 basa, mengandung 50 – 60 % G+C dan untuk kedua primer tersebut sebaiknya sama. Sekuens DNA dalam masing-masing primer itu sendiri juga sebaiknya tidak saling berkomplemen, karena hal ini akan mengakibatkan terbentuknya struktur sekunder pada primer tersebut dan mengurangi efisiensi PCR [3].

Waktu annealing yang biasa digunakan dalam PCR adalah 30 – 45 detik. Semakin panjang ukuran primer, semakin tinggi temperaturnya. Kisaran temperatur penempelan yang digunakan adalah antara 36^oC sampai dengan 72^oC, namun suhu

yang biasa dilakukan itu adalah antara 50 – 60^o C [3].

c.    Elongasi/Pemanjangan Primer (Extention)

Selama tahap ini Taq polymerase akan memulai aktivitasnya memperpanjang DNA primer dari ujung 3’ ke arah 5’. Kecepatan penyusunan nukleotida oleh enzim tersebut pada suhu 72^oC diperkirakan mencapai 35 – 100 nukleotida/detik, bergantung pada buffer, pH, konsentrasi garam dan molekul DNA target. Dengan demikian untuk produk PCR dengan panjang 2000 pasang basa, waktu 1 menit sudah lebih dari cukup untuk tahap perpanjangan primer ini. Biasanya di akhir siklus PCR waktu yang digunakan untuk tahap ini diperpanjang sampai 5 menit sehingga seluruh produk PCR diharapkan terbentuk DNA untai ganda [3].

Siklus pada proses PCR [3]

Reaksi-reaksi tersebut di atas diulangi lagi dari 25 – 30 kali (siklus) sehingga pada akhir siklus akan diperoleh molekul-molekul DNA rantai ganda yang baru yang merupakan hasil polimerasi dalam jumlah yang jauh lebih banyak dibandingkan dengan jumlah DNA cetakan (template) yang digunakan. Banyaknya siklus amplifikasi tergantung pada konsentrasi DNA target dalam campuran reaksi [3].

Produk PCR dapat diidentifikasi melalui ukurannya dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa. Metode ini terdiri atas proses injeksi DNA ke dalam gel agarosa kemudian mengaliri gel tersebut dengan listrik. Hasilnya untai DNA akan terpisah berdasarkan panjang untainya [3].

Interpretasi hasil PCR [sumber: dok. penulis]

Oleh: A.F. Wijaya

Referensi:

[1]   Kadri, K. (2019). Polymerase Chain Reaction (PCR): Principle and Applications. In Perspectives on Polymerase Chain Reaction. IntechOpen.

[2]   van Pelt-Verkuil, E., & te Witt, R. (2019). Principles of PCR. In Molecular Diagnostics (pp. 131-215). Springer, Singapore.

[3]   Zuhriana, K. Y. (2010). Polymerase Chain Reaction (PCR). Saintek, 5(6), 1-6.