Perkembangan Teknik PCR
Perkembangan
Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR)
Polymerase Chain Reaction
(PCR) adalah teknik dalam biologi molekuler untuk memperkuat satu atau beberapa
salinan potongan DNA, menghasilkan ribuan hingga jutaan salinan dari urutan DNA
tertentu [1]. PCR telah
berkembang dan berubah pesat sejak diperkenalkan pada tahun 1985. Metode awal
PCR bersifat “labor-intensive” atau sangat
memerlukan kerja keras petugas dan cukup memakan waktu. Namun kini,
kemutakhiran teknologi serta penemuan variasi metode baru mampu menyederhanakan
proses sehingga implementasi klinis jauh lebih mudah [2]. Berikut adalah perkembangan PCR, didahului pada tahun 1953
dengan penemuan struktur DNA double helix.
 |
| Perkembangan teknik PCR [3] |
Dalam
postingan kali ini, kami akan mengulas secara singkat perkembangan teknik PCR
secara umum, dimulai dari teknik awal PCR yang biasa dikenal dengan Conventional PCR (cnPCR), PCR generasi
kedua yaitu Real Time PCR, dan PCR
generasi ketiga yaitu Digital PCR.
Conventional PCR (cnPCR)
PCR konvensional (cnPCR) meniru secara in vitro kemampuan replikasi DNA alami,
yang dapat diulang dalam skala besar. Metodologi ini memerlukan, pertama,
identifikasi, setidaknya sebagian, dari target DNA untuk pengembangan primer
atau probe yang akan berhibridisasi secara khusus dengan sekuens target. Dengan
meningkatnya jumlah genom sekuens patogen, urutan DNA dapat dieksploitasi untuk
pengembangan tes diagnostik berdasarkan PCR, sebagai hasilnya, sejak dekade
terakhir, banyak tes yang tersedia secara komersial didasarkan pada teknik ini [4].
Meskipun cnPCR dan variasinya bersifat
sensitif dan spesifik, cnPCR memiliki beberapa keterbatasan salah satunya
adalah memerlukan agarosa atau gel poliakrilamida untuk elektroforesis,
memiliki risiko kontaminasi, kurangnya kapasitas yang bersifat kuantitatif, dan
penggunaan reagen seperti etidium bromida, yang berbahaya bagi kesehatan
pengguna [4]
Conventional
PCR hanya menyediakan data kualitatif (ada
atau tidak adanya DNA yang diinginkan, pemurnian DNA yang ingin diketahui) [5]. PCR konvensional
membutuhkan primer yang komplementer dengan termini DNA target. Masalah yang
biasa terjadi adalah ikatan primer dengan daerah DNA yang salah, memberikan
produk yang tidak terduga [1].
Quantitative/ Real-Time PCR
Quantitative
polymerase chain reaction (Q-PCR) adalah metode untuk
menentukan jumlah produk PCR, secara Real
Time, dan sangat berguna untuk pemeriksaan ekspresi gen [6-8]. Sering disingkat Q-PCR,
metode ini kadang-kadang juga disebut sebagai Real-Time PCR atau tergantung pada aplikasinya, quantitative reverse-transcriptase PCR (keduanya
disingkat menjadi RT-PCR, yang terkadang membingungkan karena memiliki
singkatan yang sama) [6].
Real
Time PCR dikembangkan pada tahun 1992, sebagai
penyempurnaan dari PCR asli yang dibuat oleh Kary Mullis, dan merupakan
terobosan bioteknologi yang signifikan untuk diagnosis penyakit infeksi dan parasite [4].
Digital PCR
Perkembangan PCR pada
generasi ketiga yang menarik dan berpotensi sangat kuat adalah PCR Digital [2]. Digital
PCR (dPCR) merupakan langkah besar ke depan dalam kuantifikasi asam nukleat. Selama
bertahun-tahun telah digunakan PCR kuantitatif (qPCR), memungkinkan pemantauan
amplifikasi DNA secara Real-Time yang
telah terbukti berguna untuk memperoleh pengukuran relatif, namun secara tidak
langsung, melalui penggunaan standar referensi, memberikan kuantifikasi
absolut. Pada dPCR, deteksi target secara langsung dimungkinkan, karena fragmen
DNA diisolasi dalam partisi mikro dan selanjutnya diamplifikasi. Pengukuran
fluoresensi titik akhir dari setiap partisi memungkinkan kuantifikasi absolut
asam nukleat target [9].
Ada dua jenis utama PCR Digital, PCR droplet-Digital (ddPCR) dan chamber-Digital
PCR (cdPCR). Keduanya membutuhkan instrumentasi khusus [2]. Mewakili
teknologi PCR generasi ketiga, ddPCR adalah ukuran absolut yang memungkinkan
resolusi molekul tunggal dari urutan target dengan presisi dan akurasi yang
ekstrim. Sistem ini menggunakan mikrofluida untuk mempartisi sampel menjadi
20.000 tetesan nanoliter, masing-masing merupakan reaksi PCR terpisah [10].
Sebagai penutup
dalam artikel ini, teknologi PCR telah diterapkan dan dimodifikasi secara luas
untuk menghasilkan banyak teknologi terkait untuk pemanfaatan di laboratorium
klinis untuk melakukan banyak pemeriksaan yang sebelumnya tidak tersedia.
Pengujian PCR akan selalu penting untuk diagnostik molekuler klinis secara
cepat dan mencakup berbagai disiplin ilmu medis bahkan di generasi berikutnya.
Oleh: K.N. Prajawanti
Referensi:
Referensi:
- Solanki G. Polymerase Chain Reaction. Int J Pharmacol Res. 2012;2(3):98–102.
- Cook L. PCR then and now [Internet]. 2016. Available from: https://www.mlo-online.com/continuing-education/article/13008859/pcr-then-and-now
- Thermo Fisher Scinetific. The History of PCR [Internet]. Available from: https://www.thermofisher.com/id/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/spotlight-articles/history-pcr.html
- Paiva-Cavalcanti M, Regis-da-Silva CG, Gomes YM. Comparison of Real-Time PCR and conventional PCR for detection of leishmania (leishmania) infantum infection: A mini-review. J Venom Anim Toxins Incl Trop Dis. 2010;16(4):537–42.
- Kadri K. Polymerase Chain Reaction (PCR): Principle and Applications. In: Synthetic Biology - New Interdisciplinary Science. 2019.
- Maddocks S, Jenkins R, Maddocks S, Jenkins R. Quantitative PCR: Things to Consider. In: Understanding PCR [Internet]. 2017. p. 45–52. Available from: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780128026830000046
- Deepak SA, Kottapalli KR, Rakwal R, Oros G, Rangappa KS, Iwahashi H, et al. Real-Time PCR: Revolutionizing Detection and Expression Analysis of Genes. Curr Genomics. 2007;8(4):234–51.
- Seifi M, Ghasemi A, Heidarzadeh S, Khosravi M, Namipashaki A, Mehri V, et al. Overview of Real-Time PCR Principles. Polym Chain React. 2012;
- Catarsi P. Digital PCR - Methods and Protocols. Eur J Histochem. 2019;63(4).
- Miller S. Third Generation PCR [Internet]. Bioradiation: A Resource ForLife Science Research. 2012. Available from: https://www.bioradiations.com/third-generation-pcr/
Komentar
Posting Komentar