Elektroforesis
Definisi
Elektroforesis gel adalah teknik klasik dan masih yang paling sering digunakan untuk identifikasi dan pemurnian fragmen DNA. Fragmen DNA dipisahkan berdasarkan ukuran dan bentuknya (1). Elektroforesis membutuhkan media pemisah berupa fase diam seperti sel Agarosa yang tercampur larutan buffer untuk menjaga kondisi keasaman sampel saat proses pemisahan. Alat ini sangat mendukung keterbaruan penelitian khususnya dibidang teknologi rekayasa genetika. Hasilnya akan memberikan rekam jejak berupa pita-pita pemisahan senyawa. Kecepatan gerak molekul tergantung pada nisbah (rasio) muatan terhadap massanya, serta tergantung pula pada bentuk molekulnya (2).
Elektroforesis gel adalah teknik klasik dan masih yang paling sering digunakan untuk identifikasi dan pemurnian fragmen DNA. Fragmen DNA dipisahkan berdasarkan ukuran dan bentuknya (1). Elektroforesis membutuhkan media pemisah berupa fase diam seperti sel Agarosa yang tercampur larutan buffer untuk menjaga kondisi keasaman sampel saat proses pemisahan. Alat ini sangat mendukung keterbaruan penelitian khususnya dibidang teknologi rekayasa genetika. Hasilnya akan memberikan rekam jejak berupa pita-pita pemisahan senyawa. Kecepatan gerak molekul tergantung pada nisbah (rasio) muatan terhadap massanya, serta tergantung pula pada bentuk molekulnya (2).
Prinsip Elektroforesis memiliki prinsip kerja memanfaatkan muatan listrik yang ada pada DNA yang bermuatan negatif. DNA yang dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya, maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif (3).  |
Gambar 1. Prinsip Elektroforesis: 1) DNA is extracted. 2) Isolation and amplification of DNA.
3) DNA added to the gel wells. 4) Electric current applied to the gel. 5) DNA bands are separated by size. 6) DNA bands are stained.
(Sumber: https://en.wikipedia.org/)
|
1. Persiapan Sampel
DNA diisolasi dan diproses sebelumnya (mis. menggunakan PCR) dan dibuat dalam larutan
dengan beberapa pewarna biru dasar untuk membantu memvisualisasikan pergerakan sampel
melalui gel.
2. Persiapan Gel Agarosa Tris-Acetate EDTA (TAE)
c. Penuangan gel
Buffer TAE menyediakan sumber ion untuk mengatur medan listrik selama proses elektroforesis.
Konsentrasi agarosa berasarkan berat-ke-volume dalam buffer TAE digunakan untuk menyiapkan larutan. Misalnya, jika diperlukan gel agarosa 1%, maka 1g agarosa ditambahkan ke 100 mL TAE.
Persentase agarosa yang digunakan ditentukan oleh seberapa besar atau kecil DNA yang diharapkan. Jika seseorang ingin memisahkan kumpulan pita DNA ukuran yang lebih kecil (<500bp), maka disiapkan gel agarose (> 1%) atau dengan persentase yang lebih tinggi. Semakin tinggi persentase agarosa maka kemampuan menyaringnya lebih rapat sehingga mampu meningkatkan pemisahan atau membedakan panjang DNA kecil. Larutan agarose-TAE dipanaskan untuk melarutkan agarosa.
Larutan agarose TAE dituangkan ke dalam nampan casting, setelah larutan gel mendingin dan memadat, maka terbentuk lempengan gel dengan deretan sumur di bagian atas.
d. Persiapan "chamber" elektroforesis
Gel padat ditempatkan ke dalam chamber/bilik yang diisi dengan buffer TAE. Gel diposisikan sedemikian rupa sehingga sumuran bilik paling dekat dengan elektroda negatif bilik.
e. Mengisi gel sumuran
Sumuran bilik gel diisi dengan sampel DNA dan biasanya, DNA-ladder juga dimuat sebagai referensi untuk ukuran.
f. Elektroforesis
Pastikan kutub negatif dan kutub positif terhubung ke bilik dan sumber daya listrik telah terpasang. . Nyalakan daya listrik dan sampel DNA yang bermuatan negatif akan mulai bermigrasi melalui gel dan menjauh dari elektroda negatif menuju positif.
g. Menghentikan elektroforesis dan memvisualisasikan DNA
Setelah pewarna biru dalam sampel DNA telah bermigrasi melalui gel, daya listrik dimatikan dan gel diangkat kemudian ditempatkan ke dalam larutan etidium bromida. Ethidium bromide menginterkalasi antara DNA dan terlihat dalam sinar UV. Kadang-kadang etidium bromida ditambahkan langsung ke larutan gel agarosa pada langkah 2. Gel pewarnaan etidium bromida kemudian terkena sinar UV dan gambar dapat diambil. Pita DNA divisualisasikan dari setiap jalur yang sesuai dengan sumuran bilik. DNA-ladder yang dimuat juga divisualisasikan dan panjang pita DNA dapat diperkirakan. Contoh diberikan pada gambar di bawah ini.
 |
| Gambar 2. Visualisasi pita DNA (Sumber: https://biologydictionary.net/gel-electrophoresis/) |
Oleh: K.N. Prajawanti
Referensi:
- Ylmaz M, Ozic C, Gok L. Principles of Nucleic Acid Separation by Agarose Gel Electrophoresis. In: Gel Electrophoresis - Principles and Basics. 2012. p. 33–40.
- Harahap MR. Elektroforesis: Analisis Elektronika Terhadap Biokimia Genetika. Elektrofor Anal Elektron Terhadap Biokimia Genet. 2018;2(1):21–6.
- Hikmatyar MF, Royani JI, Dasumiati. No TitleIsolasi dan Amplifikasi Dna Keladi Tikus (Thyponium flagelliform) Untuk Identifikasi Keragaman Genetik. J Bioteknol Bios Indon. 2015;2(2):42–8.
- Biologydictionary.net Editors. Gel Electrophoresis [Internet]. 2017. Available from: https://biologydictionary.net/gel-electrophoresis/
Komentar
Posting Komentar