Pewarnaan Gram / Gram Stain

Pewarnaan gram

Pewarnaan atau pengecatan Gram merupakan salah satu metode pewarnaan yang digunakan untuk membedakan jenis bakteri (Gram positif dan Gram negatif) berdasarkan warna yang dihasilkan. Pewarnaan ini memudahkan para peneliti atau klinisi dalam melakukan pemeriksaan bakteri secara mikroskopis. Pengecatan Gram ditemukan pertama kali oleh Christian Joachim Gram. Pewarnaan Gram memberikan warna biru-ungu pada bakteri Gram positif dan warna merah-merah

muda pada bakteri Gram negatif. Perbedaan warna yang dihasilkan dari pewarnaan Gram ini disebabkan karena adanya perbedaan struktur dari dinding sel bakteri. Jadi pengecatan Gram memberikan hasil yang kurang baik ketika digunakan untuk mewarnai bakteri yang memiliki dinding sel yang terlalu kecil atau sedikit, misalnya Treponema, Chlamydia, Rickettsia, dan Mycoplasma. Selain itu Mycobacteria dan Nocardia sp. juga tidak dapat diwarnai dengan pengecatan Gram biasa. Untuk organisme seperti Francisella, legionella, dan Brucella spp. pengamatan sangat sulit dilakukan, akibat dari ukurannya yang sangat kecil dan ditambah lagi bakteri ini sulit untuk diwarnai dengan pengecatan Gram konvensional, sehingga perlu dilakukan modifikasi terhadap pengecatan Gram ini (mis., mengganti Safranin dengan Carbol Fuchin yang efektif untuk mewarnai Francisella tularensis)atau juga dapat menggunakan pengecatan lain yang memberikan hasil lebih baik (Jorgensen, 2015).

Pewarnaan Gram mempermudah pemeriksaan mikroskopik apusan untuk mendeteksi bakteri, pus, basil Vincent, dan Candida albicans. Bakteri komensal, yang selalu ditemukan, tidaklah signifikan. Bakteri komensal ini tidak perlu diperiksa lebih lanjut ataupun dilaporkan (WHO, 2014).

Prinsip (WHO, 2014)

1.      Ungu kristal mewarnai semua bakteri menjadi ungu tua.

2.      Larutan iodin menahan zat warna violet secara lebih kuat atau lemah, tergantungjenis bakterinya.

3.      Etanol 95%:

a.       Memudarkan warna bakteri ketika ungu kristal tidak terikat kuat oleh larutan iodin;

b.      Tidak memudarkan warna bakteri ketika ungu kristal terikat kuat oleh larutan iodin.

4.      Larutan fuksin karbol, merah netral, atau safranin (berwarna pink):

a.       Mewarnai ulang (pink) bakteri yang warnanya dipudarkan oleh etanol;

b.      Tidak berpengaruh terhadap bakteri 'yang tetap berwarna ungu tua (tidak dipudarkan oleh etanol).

Alat dan bahan (WHO, 2014)

1.      Mikroskop

2.      Rak kaca objek

3.      Ungu kristal, modifikasi Hucker

4.      Larutan iodin lugol 0,1 %

5.      Larutan pemudar-warna aseton-etanol

6.      Larutan fuksin karbol untuk pewarnaan Ziehl-Neelsen (diencerkan 10 kali dengan etanol 95%), larutan merah netral 0,1%, atau larutan safranin.

Metode (WHO, 2014)

1.      Fiksasi apusan seperti yang diuraikan pada bagian 5.2 – 5.4.

2.      Tambahkan ungu kristal pada keseluruhan kaca objek selama 60 detik.

3.      Bilas dengan air bersih. Biarkan kaca objek mengering sebentar; selanjutnya, tambahkan iodin pada keseluruhan kaca

4.      objek selama 60 detik.

5.      Bilas dengan air bersih. Pudarkan warna segera dengan aseton-etanol, selama 2 – 3  detik saja.

6.      Tambahkan fuksin karbol pada keseluruhan kaca objek selama 2 menit.

7.      Bilas dengan air bersih dan taruh kaca objek, dengan posisi tegak, di dalam rak kaca objek dan biarkan mengering.

Pemeriksaan mikroskopik (WHO, 2014)

Pertama-tama, amati preparat dengan objektif 40x untuk melihat distribusi pulasan; selanjutnya, pakai objektif 100x (dengan minyak imersi).

Organisme positif-Gram (WHO, 2014)

Organisme positif-Gram terwarnai ungu tua (mis., stafilokokus, streptokokus, mikrokokus, pneumokokus, enterokokus, basil difteri, basil antraks).

Gambar 1. Corynebacterium diphtheriae pada Pewarnaan Gram (Gram positif) (Wikipedia.org)

Organisme negatif-Gram (WHO, 2014)

Organisme negatif-Gram terwarnai merah (mis., gonokokus, meningokokus, basil koliform, shigella, vibrio kolera, pseudomonas).

Gambar 2. Pseudomonas aeruginosa dengan Pewarnaan Gram (Gram Negatif) (Wikipedia.org)

Identifikasi organisme spesifik (WHO, 2014)

Candida albicans terlihat sebagai spora positif-Gram berukuran besar (diameter 2-4 /lm), berbentuk oval atau bulat dengan berbagai filamen mirip-miselium yang panjangnya bervariasi dan ujungnya membulat. "Actinomycetes" terlihat sebagai granula besar, kadang-kadang tampak dengan mata telanjang (berwarna putih sampai kuning). Bagian tengahnya bersifat negatif-Gram, sementara bagian tepinya bersifat positif-Gram. Organisme ini ditemukan di dalam pus dari lesi kulit, sputum, dll. Basil Vincent terlihat sebagai basil fusiformis dan spirokaeta negatif-Gram. Tidak ada lagi bakteri lain yang harus dilaporkan, mengingat banyak bakteri komensal yang sering dikira bakteri patogen.

Gambar 3. Candida albicans dengan Pengecatan Gram (yeastinfectioncause.net)

Gambar 4. Actinomycetes israelii dengan Pengecatan Gram (www.atsu.edu)

Sumber kesalahan identifikasi (WHO, 2014)

Reaksi positif-Gram palsu dapat terjadi karena:

1.      Apusan difiksasi sebelum benar-benar kering.

2.      Apusan terlalu tebal.

3.      Terdapat endapan di botol berisi ungu kristal (sa ring dulu sebelum dipakai).

4.      Larutan iodin tidak terbilas sempurna sewaktu pewarnaan.

5.      Preparat kurang lama dicelupkan ke dalam aseton-etanol.

6.      Larutan fuksin karbol (atau safranin atau merah neutral) yang dipakai terlalu pekat atau terlalu lama dibiarkan pada preparat.

Reaksi negatif-Gram palsu dapat terjadi karena (WHO, 2014):

1.      Preparat kurang lama diwarnai dengan larutan iodin.

2.      Preparat terlalu lama dicelupkan ke dalam aseton-etanol atau larutan ini tidak terbilas sempurna sewaktu pewarnaan.

References:

Anonim. 2013. Candida albicans. [internet] diakses dari situs http://yeastinfectioncause.net/2013/03/02/candida-albicans-adalah-gram-2/ pada 1 Mei 2018.

Anonim. TT Corynebacterium diphtheriae. [internet] diakses dari situs https://id.wikipedia.org/wiki/Corynebacterium_diphtheriae., pada 1 Mei 2018.

Anonim. TT. Actinomycetes israelii, [internet] diakses dari situs https://www.atsu.edu/faculty/chamberlain/Website/gallery.htm pada 1 Mei 2018.

Anonim. TT. Gram Negatif. [internet] diakses dari situs https://id.wikipedia.org/wiki/Gram-negatif.,  pada 1 Mei 2018.

Jorgensen J.H., and Michael A.P. 2015. Manual of Clinical Microbiology 11th Edition. Vol. 1, Washington, DC: ASM Press.

WHO. 2004. Pedoman teknik dasar untuk laboratorium kesehatan; alih bahasa, Chairlan, Estu Lesfari ; editor edisi bahasa Indonesia, Albertus Agung Mahode.  Ed. 2.  Jakarta : EGC, 2011.